El ensayo es un IEE competitivo directo para la medición cuantitativa de Tiroxina Total (T4 Total) en suero o plasma humano. Un agente específico desplaza al T4 de las proteínas enlazantes, dejándolo dispuesto para enlazarse a los anticuerpos. Luego el T4 se equilibra con T4 marcado con fluoresceína (Derivado del T4) al enlazarse con una cantidad limitada de anticuerpo anti-T4 marcado con fosfatasa alcalina. Después, un anticuerpo anti-fluoresceína enlazado con partículas magnéticas separa el complejo T4/fluoresceína anticuerpo-T4 de los componentes no enlazados. Una ulterior incubación con sustrato produce color en proporción inversa a la cantidad de T4 presente. El ensayo tiene quatro etapas principales:
Se incuban el agente desplazador, el anticuerpo anti-T4 marcado con fosfatasa alcalina, y el derivado de fluoresceína del T4, con la muestra (50 mL) durante 15 minutos a 37°C.
Se agrega el anticuerpo anti-fluoresceína acoplado a partículas magnéticas y se incuba durante 10 minutos a 37°C. Después se aísla el anticuerpo anti-T4 mediante un paso de lavado magnético.
Se incuba un sustrato enzimático coloreado con las partículas durante 15 minutos a 37°C. La presencia de fosfatasa alcalina provoca un cambio de color de amarillo a rosado. La reacción es terminada por la adición de Buffer de Parada.
Luego los tubos se colocan en el espectrofotómetro o colorímetro. Se puede medir la densidad óptica de cada tubo (a 550nm) y los resultados se calculan usando un programa de procesamiento de datos.
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